Цифровое моделирование и прогнозирование в медико-биологических системах

Решаемые научно-технические задачи, полученные и ожидаемые результаты

В 2020 году

1.1 Анализ особенностей, возможностей и эффективности платформенных технологий в области разработки иммунобиологических препаратов, включая получение следующих результатов:

Требования к системе моделей процессов разработки и производства иммунобиологических препаратов на основе платформенного подхода;

Требования к ИТ и цифровым технологиям, обеспечивающим деятельность по разработке и производству иммунобиологических препаратов на основе платформенного подхода;

Требования к гибкой лабораторной и производственной инфраструктуре деятельности по разработки и производству иммунобиологических препаратов на основе платформенного подхода.

1.2 Важнейшие результаты по направлению научных исследований, полученные в период реализации соглашения в отчётном году с момента заключения соглашения.

Традиционные подходы к созданию и производству иммунобиологических препаратов, в частности, вакцин, не позволяют адекватно реагировать на вновь возникающие биологические угрозы, что отчетливо продемонстрировала пандемия, вызванная вирусом SARS-CoV-2. В связи с этим наиболее перспективным направлением является разработка универсальных платформенных технологии и соответствующих производств. Ограничивающие скорость разработки вакцин стадии могут быть упрощены при использовании платформенных технологий, а производственные мощности могут в короткие сроки быть переориентированы для производства препаратов и вакцин против новых патогенов. Существует целый спектр вакцинных платформ, однако одной из наиболее перспективных является технология РНК-вакцин, в разработку различных вариантов которой за последние 2 года в мире были инвестированы миллиарды долларов. В рамках деятельности НЦМУ мы планируем создать цифровую платформу для разработки и производства вакцин на основе оригинальной технологии самореплицирующихся РНК (срРНК). Организация новых производственных процессов создания срРНК вакцин требует новых технологических решений с применением методов биоинформатики, математического моделирования и других цифровых технологий.

В результате выполнения этапа исследования разработаны:

• Требования к системе моделей процессов разработки и производства иммунобиологических препаратов на основе платформенного подхода:

Модель процессов разработки и производства препаратов срРНК на основе платформенного подхода верхнего уровня включает следующие стадии: идентификация патогена и определение его геномной последовательности, дизайн вакцинного препарата методами биоинформатики, клонирование последовательности антигена(ов) и синтез плазмидной ДНК, ферментативная наработка срРНК методом in vitro транскрипции и ее очистка, упаковка в носитель (микрокапсулы), расфасовка на отдельные дозы, пилотное производство, контроль качества, организация производства и производство вакцины. Полная система моделей процессов должна включать: детализацию указанных стадий до операционного уровня; организационную структуру и соответствующую ей модель ролей и ответственностей при реализации процесса;

• Требования к ИТ и цифровым технологиям, обеспечивающим деятельность по разработке и производству иммунобиологических препаратов на основе платформенного подхода:

ИТ-поддержка процесса должна охватывать весь конвейер этапов разработки (in silico дизайн препарата, наработка и упаковка срРНК, пилотное производство); обеспечивать качественную и количественную оценку экспериментов, стадий производства и контроля качества; предпочтительно с открытым исходным кодом

• Требования к гибкой лабораторной и производственной инфраструктуре деятельности по разработке и производству иммунобиологических препаратов на основе платформенного подхода:

Лабораторная и производственная инфраструктура деятельности должна быть гибкой, масштабируемой, интегрированной с ИТ-архитектурой деятельности. Все создаваемые лабораторные регламенты должны соответствовать требованиям GLP и должны быть оценены на предмет возможности масштабирования на производстве.

1.3 Сопоставление полученных результатов по направлению научных исследований с мировым уровнем

Полученные результаты базируются на передовых теоретических и практических знаниях научного и практикующего сообществ (компании GSK/ CureVac, Moderna/Merck, Pfizer/BioNTech, Imperial College London). Были констатированы следующие вызовы, связанные с внедрением вакцинных платформ: отсутствие единообразных согласованных определений и понимания платформенных технологий; лицензированию подлежат конкретные продукты (вакцины), а не платформы.

2.1 Разработка способов получения фармакологических веществ из природного растительного сырья и комплексные исследования их состава и свойств с использованием современные достижений в области фитохимии, комбинаторной химии и биомедицины (часть 1): Технологическая инструкция на получение каротиноидов из биомассы микроводорослей; Методика выделения абиетиновой кислоты из талловой канифоли.

2.2 Важнейшие результаты по направлению научных исследований, полученные в период реализации соглашения в отчётном году с момента заключения соглашения.

Разработан аналитический отчет (часть 1 «Природные источники лекарственных субстанций: технологии получения из растительного сырья, аналитические и цифровые методы исследования фармакологических свойств», промежуточный отчет), включающий литературный обзор источников природных веществ – вторичных метаболитов высших растений, технологии их получения из растительного сырья, видам физиологической активности аналитическим и цифровым методам исследования их фармакологических свойств.

Даны основные характеристики вторичных метаболитов высших растений, а также рассмотрены виды их физиологической активности. Приведена систематизация сведений о физиологической (фармакологической) активности растительного сырья. В результате поиска была выявлена обширная группа растений, проявляющих от 2 до 6 видов терапевтического действия, и обладающих комплексным воздействием на организм человека.

Раскрыта проблема антиоксидантной защиты биологических систем и пути ее решения, описаны кислородсодержащие свободные радикалы, фитоантиоксиданты. Показано, что жизнедеятельность всех организмов связана с окислительно-восстановительными процессами. Образующиеся при этом активированные производные молекулярного кислорода или активные формы кислорода участвуют в реакциях свободно-радикального окисления, в том числе и перекисного окисления липидов.

Избыточное накопление активных форм кислорода приводит к нарушению нормального функционирования систем естественной антиоксидантной защиты, что вызывает усиленное окислительное повреждение и химическую модификацию биомолекул и приводит к развитию дисфункции клеток и тканей организма.

Представлены аналитические методы исследования антиоксидантной активности природных веществ. Разработка инструментальных экспресс-методов определения антиоксидантных свойств в настоящее время является одной из актуальных задач современной медицины, фармации, косметологии и пищевой промышленности. Показано, что методы исследования общей антиоксидантной активности (АОА) различаются по типу источника окисления, окисляемого соединения и способа измерения окисленного соединения. Эти методы дают широкий спектр результатов. Так, по способам регистрации АОА методы подразделяют на волюмометрические, фотометрические, хемилюминесцентные, флуоресцентные, электрохимические и ряд более специфических.

Приведена систематизация современных способов экстракции природных соединений из растительного сырья с применением высокотехнологичного оборудования, безопасных экстрагентов и энергоэффективных технологий. Подробно описаны методы вихревой экстракции (турбоэкстракции), виброэкстракции, экстракции с применением ультразвуковых и инфразвуковых волн, электродинамической мацерации, центробежной экстракции, экстракции с воздействием электромагнитного или электрического поля и другие виды. Подчеркнуто, что приемы экстрагирования ценных веществ из природного растительного сырья широко распространены в современной фармакологической практике, как наиболее перспективное направление получения биологически активных веществ, как основных компонентов лекарственных форм.

Представлено современное состояние проблемы по поиску природных растительных источников лекарственных субстанций. Отмечено, что биологически активные вещества, полученные из сырья растительного происхождения, являются перспективным источником для создания лекарственных препаратов. В качестве перспективных источников обозначены микроводоросли и способы получения из них ценных компонентов таких как каротиноиды. Приведено подробное описание фармакологических свойства каротиноидов. Приведены результаты патентного поиска способов получения каротиноидов из биомассы микроводорослей с учетом современных разработок в этой области в России и за рубежом.

Описаны способы получения смоляных кислот и продуктов их модификации в качестве перспективных источников ценных фармпрепаратов, сырьевым источником которых является канифоль.

Представлен обзор научных исследований в области химии растительного сырья и их отдельных компонентов, методов выделения ценных фитохимических веществ, характеристик и способов глубокой химической модификации последних. Отмечено, что потребность в принципиально новых продуктах на основе отдельных компонентов древесины, обладающих широким спектром уникальных свойств, приводит к необходимости поиска нетрадиционных способов химической модификации компонентов растительного сырья, а благодаря уникальному строению молекул смоляные кислоты представляют собой ценное сырье для синтеза различных биологически-активных веществ, проявляющих противовирусную активность.

Перспективным сырьем для получения биологически активных веществ является живичная и талловая канифоль, как богатый источник трициклических карбоновых кислот. Исследованная физиологическая активность смоляных кислот, позволяет рекомендовать ее использовать в качестве лекарственной субстанции.

Для прогнозирования фармакологического действия биомолекул приведена информация по принципам использования программного продукта PASS Online.

Результаты патентного поиска позволили оценить состояние проблемы применения противовирусных препаратов на основе производных смоляных кислот (дегидроабиетиновая кислота) и подтвердили актуальность данного направления исследований.

В результате выполнения исследования разработаны:

- Технологическая инструкция, описывающая получение лабораторного образца каротиноидов из биомассы микроводорослей Chlorella.

- Методика выделения абиетиновой кислоты из талловой кислоты.

2.3 Сопоставление полученных результатов по направлению научных исследований с мировым уровнем

Для сопоставления полученных результатов научным исследованиям мирового уровня проведен аналитический обзор зарубежных научных публикаций и патентный поиск, который подтверждает актуальность обозначенных направлений научных исследований в сфере разработки природных источников лекарственных субстанций, технологий их получения из растительного сырья, аналитических и цифровых методов исследования фармакологических свойств.

Патентный поиск способов получения каротиноидов из биомассы микроводорослей и применения противовирусных препаратов на основе производных смоляных кислот выполнен за период с 1994 по 2019 гг. с использованием компьютерной базы данных Европейского патентного ведомства (Espacenet) по ведущим странам мира: РФ, США, ЕС, Великобритании, Германии, Нидерландов, Франции, Японии, Китая, Южной Кореи, Израиля Результаты патентного поиска свидетельствуют, что в Нидерландах, Германии, США и Израиле активно проводятся исследования по получению и выделению каротиноидов из биомассы микроводорослей.

3.1 Освоение современных методов прижизненной визуализации активности нейросетей на животных (минископ): предварительный вариант протоколов прижизненной визуализации активности нейросетей.

3.2 Важнейшие результаты по направлению научных исследований, полученные в период реализации соглашения в отчётном году с момента заключения соглашения.

Нейродегенеративные заболевания – это группа заболеваний нервной системы, характеризующаяся прогрессирующей гибелью определенных групп нервных клеток, и, как следствие, атрофией соответствующих отделов головного и/или спинного мозга. Постепенная дегенерация нервной ткани приводит к прогрессирующим психическим расстройствам, деменции, нарушениям двигательной и когнитивной функции, и в конечном счете к полной потере способности к самообслуживанию и смерти. В лаборатории молекулярной нейродегенерации (ЛМН) осуществляется поиск потенциальных терапевтических стратегий для лечения таких нейродегенеративных заболеваний, как Болезнь Альцгеймера (БА), Болезнь Хантингтона (БХ) и спиноцеребеллярная атаксия 2 типа (СЦА2). В настоящее время все более необходимым становится получение научных результатов, направленных на разработку новых технологий и новых способов диагностики и лечения нейродегенеративных заболеваний не только на модельных клеточных системах, на выделенных клеточных культурах нейронов и срезах мозга, но и на целых животных, в особенности, свободно движущихся. Помимо проведения поведенческих тестов на лабораторных животных, огромный интерес представляют исследования изменений активности нейронных сетей у свободно движущихся мышей с нейропатологиями с помощью современных методов кальциевой визуализации in vivo. Таким образом, можно визуализировать не только морфологию нейронов, но и нейрональную активность in vivo, что достигается с помощью специальных сенсоров, которые флуоресцируют при изменении концентрации различных ионов, например, кальция. Оригинальным подходом, позволяющим проводить подобный анализ, является использование однофотонных миниатюрных флуоресцентных микроскопов – минископов. Они имеют небольшие размеры при хорошем разрешении, размещаются на голове животного и не мешают его свободному движению, что делает возможным их использование в ходе проведения поведенческих тестов.

Для оценки изменения активности нейронов с помощью минископа используются различные индикаторы, например, генетически кодируемый кальциевый индикатор GCamp, сенсоры потенциала на мембране и др., что делает данный метод перспективным в изучении нейрональной активности.

За отчетный период проекта мы ожидаем провести анализ литературных данных, отражающих возможности применения минископов для анализа свободно движущихся мышей с нейропатологиями, предварительно отработать протоколы по методике имплантации минископа с последующей визуализацией активности нейронов гиппокампа. С использованием разработанной технологии в результате выполнения проекта будут получены качественно новые данные о механизме патогенеза нейродегенеративных заболеваний, что в свою очередь позволит сделать выводы о причинах и потенциально возможных способах лечения и/или предотвращения их развития.

Для дальнейшего анализа данных, полученных с помощью минископа, мы предполагаем разработать инструмент, совмещающий в себе первичный анализ видеозаписи, нахождение взаимосвязей между нейронами из нескольких экспериментов, а также позволяющий провести анализ корреляций между активациями единичных нейронов на платформе - MATLAB (MathWorks). Данная платформа удобна поскольку позволяет объединить алгоритмы и их реализации других исследователей, а также использовать разработанный инструмент и его исходный код для дальнейших исследований.

4.1 Разработка и изготовление мультиэлектродов для прижизненной визуализации электрической активности нейросетей: предварительный чертеж микросхемы мультиэлектрода для прижизненной визуализации локального потенциала поля.

4.2 Важнейшие результаты по направлению научных исследований, полученные в период реализации соглашения в отчётном году с момента заключения соглашения

Раздел проекта по разработке и изготовлению мультиэлектродов для прижизненной визуализации электрической активности нейросетей сфокусирован на продолжении разработки макета беспроводного электрофизиологического комплекса для регистрации локального потенциала поля мозга мыши.

В ходе проведения этапа разрабатывались схемы принципиальные электрические и печатные платы носимого модуля и базовой зарядной станции, а также архитектура и функциональная схема программного приложения для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников.

В ходе выполнения работ получены схемы принципиальные электрические и печатные платы носимого модуля и базовой зарядной станции, собран отладочный комплект из трех носимых модулей и одной базовой станции. Также выполнен анализ требований к программному приложению для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников, сформированы его структурная и функциональная схемы.

4.3 Сопоставление полученных результатов по направлению научных исследований с мировым уровнем

Научные разработки в рамках настоящего проекта являются частью общей мировой тенденции поиска наиболее информативных способов визуализации нейрональной активности in vivo, анализу функционирования не отдельных нейронов, а нейронных ансамблей, взаимодействия коррелирующих нейронов. Одной из основных преимуществ методики «минископ» является возможность регистрировать активность нейрональной сети в бодрствующих свободно движущихся животных в течение продолжительного промежутка времени.

По мере того, как исследователи стремились разобраться в деталях и функциях нейронной активности, были разработаны инструменты, способные отображать эту активность на уровне популяции нейронов у свободно движущихся животных [Rector, Harper, 1991]. Одним из примеров является оптоволоконный массив, разработанный для визуализации флуктуаций мембранного потенциала на уровне популяции нейронов коры головного мозга свободно движущихся животных [Ferezou et al., 2006]. В последующие годы многочисленные группы [Engelbrecht et al., 2008; Helmchen et al., 2001; Sawinski et al., 2009] разработали двухфотонные миниатюрные микроскопы, которые могли отображать динамику мозгового кровотока и колебания кальция в небольших группах нейронов, но, учитывая трудности, связанные с внедрением этих инструментов, они не получили широкого распространения [Aharoni et al., 2019]. Примерно в то же время прогресс в области генетически кодируемых кальциевых индикаторов [Tian et al., 2009] и КМОП-датчиков (комплементарные металлооксидные полупроводники) изображения портативных камер и мобильных телефонов сделали возможным использование однофотонной широкополосной визуализации на свободно движущихся животных [Ghosh et al., 2011; Park et al., 2011].

Новаторская работа показавшая, что широкополосная эпифлуоресцентная визуализация может быть достигнута с помощью миниатюрных микроскопов была проведена в лаборатории Марка Шнитцера (Schnitzer) в Стэнфорде [Flusberg et al., 2008]. На ее основе коммерческие компании разработали собственные версии минископов, однако они были чрезмерно дорогими и не имели возможности гибко модифицироваться и настраиваться под нужды исследователей (Inscopix NVista) [Jennings et al., 2015]. В результате, сообществом исследователей на основе открытого исходного кода были созданы гибкие с точки зрения модификаций, доступные по цене широкополосные миниатюрные микроскопы, такие как UCLA Miniscope [Cai et al., 2016], FinchScope [Liberti et al., 2017], CHendoscope [Jacob et al., 2018] и MiniScope [Zhang et al., 2019].

Основной движущей силой разработки миниатюрных микроскопов является, прежде всего, их способность регистрировать активность многих нейронов с определенной топологией у животного, которое может проявлять свое естественное врожденное поведение.

Кроме того, минископы позволяют проанализировать нейронную активность, лежащую в основе поведения в широком спектре поведенческих анализов, разработанных за последние десятилетия [Gomez-Marin et al., 2014; Graeff et al., 1998; Morris, 1984; Nadler et al., 2004]. В результате точное отслеживание поведения и количественная оценка [Mathis et al., 2018; Mimica et al., 2018; Pereira et al., 2019; Wiltschko et al., 2015] становятся важными для понимания того, как активность, зарегистрированная в целевых регионах, может быть соотнесена с поведением. С помощью минископа регистрировалась активность нейронов у мышей в процессе вызова воспоминаний [Cai et al., 2016]. Авторами было показано, что при кодировании различной информации, полученной последовательно через короткие промежутки времени, формируется общий нейронный ансамбль, связывающий воспоминания. Кодирование последовательных событий сопровождалось перекрытием формирующихся нейронных путей в области CA1 гиппокампа, при этом степень их перекрытия была выше при получении информации в рамках одного дня, чем с недельным интервалом. Параллельно были проведены аналогичные исследования на взрослых мышах. В результате применение миниатюрного флуоресцентного микроскопа позволило определить причину ослабления когнитивных функций при старении, а именно нарушение формирования общего нейронного ансамбля, обусловленное снижением возбудимости нейронов [Cai et al., 2016].

В другом исследовании применение минископа показало, что десинхронизация интернейронов между CA1 и зубчатой извилиной приводит к нестабильности пространственной памяти, которая сохраняется лишь в течение нескольких минут [Shuman et al., 2020].

В дополнение ко всему выше сказанному использование миниатюрной флуоресцентной микроскопии может помочь оценить воздействие различных фармакологических препаратов, например, снижающих повышенную возбудимость при неврологических заболеваниях головного мозга [Werner et al., 2019].

Визуализация посредством минископа позволяет получать изображения ранее недоступных популяций нейронов в глубине мозга свободно движущихся животных [Flusberg et al., 2008; Ghosh et al., 2011; Ziv, Ghosh, 2015]. Тем не менее, с точки зрения обработки полученных с помощью минископа данных, которые представляют собой видеофайлы, сложно извлечь активность отдельных нейронов из-за очень больших флуктуаций фона и сильных пространственных перекрытий. Процесс обработки таких данных можно разделить на несколько этапов: фильтрация полученных кадров от шумов, компенсация сдвигов и искажений изображения, выделение и анализ активных нейронов.

Данные с однофотонного минископа практически всегда сопровождаются постоянно меняющимся шумным задним фоном, что, как правило, связано с изменением активности нейронов или с постепенным выгоранием флуоресцентного индикатора. Еще одной проблемой в обработке данных являются сдвиги и искажения, которые характерны для поведенческих экспериментов. Для последующей обработки данных важно исправить все сдвиги и искажения, т.е. выровнять кадры во время всей видеозаписи нейрональной активности. Для решения этой задачи применяются различные методы, например, подход, в котором кадры видеозаписи регистрируют через сопоставление шаблонов на основе предположения, что основной формой движений является поступательное перемещение [Dubbs et al., 2016; Lu et al., 2018]. Заключительным этапом после коррекции шумов и сдвигов является процесс идентификации активности нейронов [Lu et al., 2018].

Основными методами (подходами), которые первоначально применялись для обработки данных, полученных с помощью минископа были: полуручной анализ ROI (Region Of Interest -интересующая область изображения) [Barbera et al., 2016; Klaus et al., 2017; Pinto, Dan, 2015] и анализ PCA/ICA [Mukamel et al., 2009]. анализ ROI не позволял эффективно разделять сигналы перекрывающихся в пространстве нейронов, помимо этого отрисовка ROI являлась трудоемким процессом, когда речь шла об обработке большого количества нейронов. Также важно отметить, что во многих случаях фоновые шумы не корректировались должным образом, что приводило к зашумленности извлеченных сигналов и частичной или полной невозможности их последующего анализа. Что касается анализа PCA/ICA, то это линейный метод разделения сигналов, который в большинстве случаев мало эффективен из-за наличия пространственных перекрытий [Pnevmatikakis et al., 2016] в данных, получаемых с помощью минископа. В связи с этим для решения проблем с изменением фона и сильными пространственными перекрытиями был предложен метод ограниченной неотрицательной матричной факторизации (CNMF) для одновременного определения шума, деконволюции и разделения сигналов из данных визуализации нейрональной активности [Pnevmatikakis et al., 2016]. Однако современные реализации подхода CNMF были оптимизированы для двухфотонной и световой микроскопии, где фон имеет более простую пространственно-временную структуру, что негативно сказывалось на обработке полученных данных. Поскольку сильные фоновые сигналы в значительной степени неизбежны в контексте однофотонной визуализации, недостаточное удаление фона может привести к проблемным выводам в последующем анализе.  По этой причине был разработан расширенный подход (метод) ограниченной неотрицательной матричной факторизации (CNMF-E) [Zhou et al., 2018], который является одним из основных методов (подходов) для извлечения активности отдельных нейронов из in vivo данных, полученных с помощью минископа. Его отличительной особенностью в сравнении с CNMF и другими методами является более точное удаления загрязняющих фоновых компонентов, а также возможность использования как в автоматическом, так и в полуавтоматическом режиме, что приводит к значительному улучшению точности анализа по сравнению с предыдущими методами. аравне с методом CNMF_E также активно используется его улучшенная версия - MIN1PIPE, которая имеет целый ряд преимуществ по сравнению с вышеизложенными алгоритмами обработки видеозаписей однофотонной микроскопии [Lu et al., 2018]. Отличительной особенностью метода MIN1PIPE по сравнению методами PCA/ICA и CNMF-E, в большей степени опирающиеся на стабильное поле изображения, является наличие улучшенного модуля коррекции движений.

Полученные после обработки методом CNMF_E или MIN1PIPE данные представляют собой дискретные сигналы флуоресценции нейронов на протяжении всех кадров видеопоследовательности. Для дальнейшего анализа, необходимо извлечь значимые параметры данного сигнала. Значения параметров могут варьироваться в зависимости от исследуемой области и соотношения сигнал-шум. Для фильтрации сигнала могут применяться алгоритмы динамического программирования, временной свертки, техники машинного обучения и различные высоко- и низкочастотные фильтры [Oh et al., 2019].

Основными параметрами сигнала активности нейрона могу быть пиковая амплитуда и пиковая частота [Oh et al., 2019]. Параметр пиковой амплитуды сигнала является более значимым, и может быть зарегистрирован как отклонение более 3-х сигм от средней активности нейрона [Kitamura et al., 2017]. Согласно этому правилу, приблизительно с вероятностью 0,9973 значение нормально распределенной случайной величины лежит в интервале , где  - математическое ожидание этой случайной величины. Вычисленные дополнительные параметры сигналов интенсивности флуоресценции нейронов используются, например, для выявления корреляций активации различных групп нейронов.

Более высокоуровневым анализом является определение изменений активности как единичных, так и групп коррелирующих нейронов в течение серии экспериментов. Для решения данной задачи сначала необходимо найти соответствие между нейронами на различных видеопоследовательностях. Одним из алгоритмов, вычисляющих подобную взаимосвязь, является алгоритм CellReg [Sheintuch et al., 2017], состоящий из трех этапов: выравнивание изображений, расчет вероятностной модели и кластеризация результатов.

Представленный алгоритм CellReg является инструментом, который используется отдельно после извлечения активностей нейронов. Для удобства анализа данных, мы предполагаем разработать инструмент, совмещающий в себе первичный анализ видеозаписи алгоритмами CNMF_E или MIN1PIPE, нахождение взаимосвязей между нейронами из нескольких экспериментов алгоритмом CellReg, а также позволяющий провести анализ корреляций между активациями единичных нейронов. Выбранная платформа - MATLAB (MathWorks), позволяющая с одной стороны, легко объединить алгоритмы и их реализации других исследователей, а с другой – использовать разработанный инструмент и его исходный код для дальнейших изысканий.

Раздел проекта по разработке и изготовлению мультиэлектродов для прижизненной визуализации электрической активности нейросетей, также, находится в тренде мировых разработок. Мультиэлектродные комлексы позволяют регистрировать электрическую активность нейронов свободно передвигающихся животных. Исследовать изменения в ответных реакциях при проведении поведенческого тестирования. Отличительной особенностью таких систем, чрезвычайно важной для исследовательской, а, в перспективе, и практической медицинской деятельности, является возможность совмещения мультиэлектродов с регулирующими активность нейронов элементами конструкций. Так, такие системы могут иметь в своем составе оптическое волокно, что позволит использовать в данном случае преимущества оптогенетической методики [Matveev et al., 2016].

5.4.4. Список использованных источников

• Aharoni D., Khakh B.S., Silva A.J., Golshani P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nat Methods. 2019.16:11-13.
• Barbera G., Liang B., Zhang L., Li Y., Lin D.T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. J Neurosci Methods. 2019.323:56-60.
• Cai D.J., Aharoni D., Shuman T., Shobe J., Biane J., Song W., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 2016.534:115-8.
• Dubbs A., Guevara J., Yuste R. moco: Fast Motion Correction for Calcium Imaging. Front Neuroinform. 2016.10:6.
• Engelbrecht C.J., Johnston R.S., Seibel E.J., Helmchen F. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 2008.16:5556-64.
• Ferezou I., Bolea S., Petersen C.C. Visualizing the cortical representation of whisker touch: voltage-sensitive dye imaging in freely moving mice. Neuron. 2006.50:617-29.
• Flusberg B.A., Nimmerjahn A., Cocker E.D., Mukamel E.A., Barretto R.P., Ko T.H., Burns L.D., Jung J.C., Schnitzer M.J. High-speed, miniaturized fluorescence microscopy in freely moving mice. Nat Methods. 2008.5:935-8.
• Ghosh K.K., Burns L.D., Cocker E.D., Nimmerjahn A., Ziv Y., Gamal A.E., Schnitzer M.J. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 2011.8:871-8.
• Gomez-Marin A., Paton J.J., Kampff A.R., Costa R.M., Mainen Z.F. Big behavioral data: psychology, ethology and the foundations of neuroscience. Nat Neurosci. 2014.17:1455-62.
• Graeff F.G., Netto C.F., Zangrossi H., Jr. The elevated T-maze as an experimental model of anxiety. Neurosci Biobehav Rev. 1998.23:237-46.
• Helmchen F., Fee M.S., Tank D.W., Denk W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 2001.31:903-12.
• Jacob A.D., Ramsaran A.I., Mocle A.J., Tran L.M., Yan C., Frankland P.W., Josselyn S.A. A Compact Head-Mounted Endoscope for In Vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Curr Protoc Neurosci. 2018.84:e51.
• Jennings J.H., Ung R.L., Resendez S.L., Stamatakis A.M., Taylor J.G., Huang J., Veleta K., Kantak P.A., Aita M., Shilling-Scrivo K., Ramakrishnan C., Deisseroth K., Otte S., Stuber G.D. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 2015.160:516-27.
• Kitamura T., Ogawa S.K., Roy D.S., Okuyama T., Morrissey M.D., Smith L.M., Redondo R.L., Tonegawa S. Engrams and circuits crucial for systems consolidation of a memory. Science. 2017.356:73-78.
• Klaus A., Martins G.J., Paixao V.B., Zhou P., Paninski L., Costa R.M. The Spatiotemporal Organization of the Striatum Encodes Action Space. Neuron. 2017.96:949.
• Liberti W.A., Perkins L.N., Leman D.P., Gardner T.J. An open source, wireless capable miniature microscope system. J Neural Eng. 2017.14:045001.
• Lu J., Li C., Singh-Alvarado J., Zhou Z.C., Frohlich F., Mooney R., Wang F. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Rep. 2018.23:3673-3684.
• Matveev M. V., A I Erofeev, O A Zakharova, E N Pyatyshev, A N Kazakin and O L Vlasova. Implantable optical-electrode device for stimulation of spinal motoneurons/ Journal of Physics: Conference Series 741(2016) 012071.
• Mathis A., Mamidanna P., Cury K.M., Abe T., Murthy V.N., Mathis M.W., Bethge M. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018.21:1281-1289.
• Mimica B., Dunn B.A., Tombaz T., Bojja V., Whitlock J.R. Efficient cortical coding of 3D posture in freely behaving rats. Science. 2018.362:584-589.
• Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 1984.11:47-60.
• Mukamel E.A., Nimmerjahn A., Schnitzer M.J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 2009.63:747-60.
• Oh J., Lee C., Kaang B.K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. Korean J Physiol Pharmacol. 2019.23:237-249.
• Nadler J.J., Moy S.S., Dold G., Trang D., Simmons N., Perez A., Young N.B., Barbaro R.P., Piven J., Magnuson T.R., Crawley J.N. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 2004.3:303-14.
• Park J.H., Platisa J., Verhagen J.V., Gautam S.H., Osman A., Kim D., Pieribone V.A., Culurciello E. Head-mountable high speed camera for optical neural recording. J Neurosci Methods. 2011.201:290-5.
• Pereira T.D., Aldarondo D.E., Willmore L., Kislin M., Wang S.S., Murthy M., Shaevitz J.W. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 2019.16:117-125.
• Pnevmatikakis E.A., Soudry D., Gao Y., Machado T.A., Merel J., Pfau D., Reardon T., Mu Y., Lacefield C., Yang W., Ahrens M., Bruno R., Jessell T.M., Peterka D.S., Yuste R., Paninski L. Simultaneous Denoising, Deconvolution, and Demixing of Calcium Imaging Data. Neuron. 2016.89:285-99.
• Rector D., Harper R. Imaging of hippocampal neural activity in freely behaving animals. Behav Brain Res. 1991.42:143-9.
• Sawinski J., Wallace D.J., Greenberg D.S., Grossmann S., Denk W., Kerr J.N. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009.106:19557-62.
• Sheintuch L., Rubin A., Brande-Eilat N., Geva N., Sadeh N., Pinchasof O., Ziv Y. Tracking the Same Neurons across Multiple Days in Ca(2+) Imaging Data. Cell Rep. 2017.21:1102-1115.
• Shuman T., Aharoni D., Cai D.J., Lee C.R., Chavlis S., Page-Harley L., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nat Neurosci. 2020.23:229-238.
• Tian L., Hires S.A., Mao T., Huber D., Chiappe M.E., Chalasani S.H., Petreanu L., Akerboom J., McKinney S.A., Schreiter E.R., Bargmann C.I., Jayaraman V., Svoboda K., Looger L.L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 2009.6:875-81.
• Werner C.T., Williams C.J., Fermelia M.R., Lin D.T., Li Y. Circuit Mechanisms of Neurodegenerative Diseases: A New Frontier With Miniature Fluorescence Microscopy. Front Neurosci. 2019.13:1174.
• Wiltschko A.B., Johnson M.J., Iurilli G., Peterson R.E., Katon J.M., Pashkovski S.L., Abraira V.E., Adams R.P., Datta S.R. Mapping Sub-Second Structure in Mouse Behavior. Neuron. 2015.88:1121-1135.
• Zhang L., Liang B., Barbera G., Hawes S., Zhang Y., Stump K., Baum I., Yang Y., Li Y., Lin D.T. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Curr Protoc Neurosci. 2019.86:e56.
• Zhou P., Resendez S.L., Rodriguez-Romaguera J., Jimenez J.C., Neufeld S.Q., Giovannucci A., Friedrich J., Pnevmatikakis E.A., Stuber G.D., Hen R., Kheirbek M.A., Sabatini B.L., Kass R.E., Paninski L. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 2018.
• Ziv Y., Ghosh K.K. Miniature microscopes for large-scale imaging of neuronal activity in freely behaving rodents. Curr Opin Neurobiol. 2015.  32:  141-7.

5.1 Разработка среды для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников (первый этап).

Ожидаемые результаты:

Описание планируемых результатов разработки среды для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников (первый этап), позволяющей сократить время и стоимость проектирования мультиэлектродов.

5.2 Важнейшие результаты по направлению научных исследований, полученные в период реализации соглашения в отчётном году с момента заключения соглашения.

Разрабатываемое программное приложение для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников должно обеспечивать доступ к прикладному ПО для создания, компиляции и отладки программного кода для используемых микроконтроллеров STM32, в том числе к инструментам, которые значительно облегчают создание и повышают скорость разработки встраиваемого ПО: библиотекам нижнего и среднего уровня, различным специализированным утилитам, интегрированным средам разработки, например, STM32CubeMX, AC6 System Workbench (SW4STM32), Atolic TrueStudio.

Структурная схема программного приложения для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников включает следующие подсистемы:

• Авторизации;
• ПО разработчика (для создания встраиваемого ПО для носимого модуля мультиэлектрода и базовой зарядной станции - модули создания, компиляции и отладки программного кода, модули интеграции с программными инструментами - библиотеками нижнего и среднего уровня, различными специализированными утилитами, интегрированными средами разработки, например, STM32CubeMX, AC6 System Workbench (SW4STM32), Atolic TrueStudio, модули конфигурирования мультиэлектродов и базовой зарядной станции);
• ПО инженера–исследователя (модули настройки и управления мультиэлектродами и базовой зарядной станцией, модули сбора, анализа, визуализации данных, модуль планирования эксперимента, модуль формирования отчета);
• Хранения данных;
• Программное приложение для работы распределенных групп инженерных и научных сотрудников должно обеспечивать следующую функциональность;
• Сбор, запись, хранение экспериментальных данных; 
• Планирование экспериментов – создание плана эксперимента, структуры входных и выходных данных, критериев результативности выполнения заданий в ходе эксперимента, определение перечня альтернативных вариантов анализа данных по результатам экспериментов; 
• Анализ данных - оценка альтернативных вариантов с наглядным представлением процесса анализа проверкой каждого варианта;
• Контроль процесса эксперимента – хода и результативности выполнения заданий;
• Просмотр и визуализация - открытие файлов данных по результатам экспериментов для просмотра, просмотр данных по результатам экспериментов в различных форматах, просмотр данных по результатам экспериментов совместно с другими участниками проекта в режиме реального времени;
• Осуществление процесса документооборота - формирование протоколов и отчетов по экспериментам, организация хранения и передачи данных по результатам экспериментов и документов;
• Организация рабочих процессов и совместной работы участников проекта - инженеров-исследователей и инженеров- разработчиков;
• Создание встраиваемого ПО для носимого модуля мультиэлектрода и базовой зарядной станции - создания, компиляции и отладки программного кода, интеграции с программными инструментами, конфигурирования мультиэлектродов и базовой зарядной станции;
• Настройка и управление мультиэлектродами и базовой зарядной станцией.